Dış Kaynaklı Proje Süreçleri Yönetim Sistemi
Al S. (Yürütücü), Gram A. , Al Ö. , Hızlısoy H.
Gıda kaynaklı patojenlerin intestinal epitel hücrelere invazyonu ve akabinde konak hücrelerde bazı bildirimler gelişmekte ve özellikle antijenik determinant olarak dikkat çeken bakteriyel yapıların konak hücre reseptörleri tarafından tanınması ile konak hücrede doğal immun yanıt şekillenmektedir. Non-typhoidal Salmonella enfeksiyonlarında hücresel adezyon ve invazyon sonucunda NLRP3 ve NLRC4 gibi NOD (nükleotid bağlayıcı oligomerizasyon alanı)-benzeri hücre içi reseptörler vasıtası ile konak hücrede gasdermin D (GSDMD) sentezi indüklenmektedir. Bakteriyel enfeksiyonlarda konak hücre savunması için esansiyel olan bu protein sayesinde konak hücre pripitozis cevabı geliştirerek intraselüler bakteri replikasyonunun önüne geçmektedir. Proje önerisinde bu yolaklar üzerine Lentilactobacillus kefiri ve Lactobacillus acidophilus’dan elde edilen hücre ari süpernatantların (cell free supernatant; CFS) etkinliğinin araştırılması planlanmaktadır. Yapılan literatür taramalarında konak hücre doğal yanıtı, inflamazom ve Salmonella’nın konak hücrelere invazyonu üzerine CFS’lerin etkinliğinin gösterildiği bir araştırmaya rastlanmamıştır. Ayrıca proje önerisi ile Salmonella invazyon mekaniği efektör proteinlerinin hücresel piropitozis ve sitokin yanıtları ve inflamozom yolakları üzerine etkinlikleri kapsamlı olarak ilk defa irdelenecektir. Bu açıdan bakıldığında özgün hipotezi ile mevcut proje önerisinin bilimsel olarak önemli bir açığı kapatacağı düşünülmektedir. Bu amaçla insan kolorektal adenokarsinoma hücre hatları (ATCC C2BBe1 [Caco-2 klonu] ve ATCC HT-29) deneysel olarak Salmonella Typhimurium ATCC 13311 ile enfekte edilecektir. Enfekte edilen hücre hatlarında kontrollü olarak gentamisin koruma deneyi ile invaze bakteri sayıları belirlenerek CFS’in Salmonella invazyonu üzerine etkinliği ortaya konulacaktır. Salmonella invazyonunda kullanılan T3SS’in (Tip Üç sekretuar sistemi) düzenlenmesinde görev alan, Salmonella patojenite adası-5 (SPI-5) içinde lokalize genlerin kodladığı pipA, pipB, pipC ve pipD efektör proteinlerinin Lambda Red Homoloji ile kombine edilmiş CRISPR-CAS9 tekniği ile geri dönüşümsüz olarak susturulması planlanmaktadır. Böylece bu efektör proteinlerin intraselüler invazyon, inflamazom ve propitozis üzerine etkinlikleri belirlenecektir. İnvazyondan önce monolayer konak hücre hatlarında spesifik siRNA’lar kullanılarak NLRP3 ve NLRC4 genleri susturularak söz konusu yolakların öneminin ve CFS’in bu yolaklar üzerine etkisinin ortaya konulması planlanmaktadır. Salmonella enfeksiyonu esnasında inflamozom ilişkili bu yolakların ve CFS’in hücresel erken ve geç apopitoz yüzdeleri üzerine etkinliği 24. saat sonunda Annexin V-FITC boyama ile flow sitometrik olarak belirlenecektir. Eş zamanlı olarak, CFS’lerin Salmonella invazyon ilişkili bazı virulens genler (hilA, iagB, sipA, sipB, invE, prgJ, prgI, prgH, pipA, pipB, pipC ve pipD) ve hücresel proinflamatuar sitokinler ve kemokinlerin gen ekspresyonu (IL-1β, TNFα, NFKβ, IL-6, IL-8 ve IL-18) üzerine etkinliğinin özgün olarak proje için dizayn edilmiş primer çiftleri ile araştırılması planlanmaktadır. Spesifik olarak gen susturulmuş hücre hatlarına Salmonella invazyonu esnasında uygulanacak CFS’in LPS ve flagellin ilişkili casp1 ve casp4/5 yolakları son ürünü olan gasdermin D protein ekspresyonu üzerine etkisi western blotting ile kantitatif olarak değerlendirilecektir. Ayrıca GSDMD ilişkili IL-18 ve IL-1β sitokin düzeylerinin de ELISA ile ortaya konulması planlanmaktadır. Proje ile temel olarak denetlenecek özgün hipotezler; (i) L. kefiri ve L. acidophilus postbiyotiklerinin Salmonella invazyonu üzerine etkinliği; (ii) Salmonella invazyon mekanizması ve oluşturduğu hücresel yanıtta T3SS efektör proteinleri olan pipA, pipB, pipC ve pipD’nin rolleri ve (iii) CFS’lerin Salmonella invazyonu esnasında hücresel yanıt ve NLRP3 ve NLRC4 inflamazom yolakları üzerine etkinliğinin ortaya konulması olarak belirlenmiştir. Bu proje önerisi ile probiyotik nitelikli olan, fonksiyonel gıdalarda kullanılabilen ve geleneksel fermente gıdalarda doğal olarak bulunabilen söz konusu probiyotiklerin metabolitleri ile hücresel doğal yanıt açısından gösterdiği destek ve hücre içi enfeksiyon ilişkili yolaklar üzerine etkileri, moleküler mekanizmalar eşliğinde açığa çıkartılacaktır. Böylece intestinal patojenlerin baskılanmasında doğal mikrobiyotaya önemli katkılar sağlayan fermente gıdalar ve probiyotik son ürünlerinin önemi ortaya konulacaktır. Bu çalışma sonucunda elde edilecek veriler yurt içi veya yurt dışı ortaklı ve/veya destekli araştırma makaleleri, bilimsel bildiriler ve yeni hipotezler barındıran projeler için özgün kaynak teşkil edebilecek niteliktedir. Özellikle projede görev alacak yüksek lisans ve doktora bursiyerlerinin tez çalışmaları bu kapsamda gerçekleştirilerek projenin yaygın etkisi güçlendirecektir.